農(nóng)殘級乙酸乙酯：色譜法在藥物研發(fā)中的一般應(yīng)用
農(nóng)殘級乙酸乙酯彪仕奇帶您了解色譜法在藥物研發(fā)中的一般應(yīng)用，薄層色譜（TLC）法主要用于藥物的定性鑒別，可從斑點的位置（Rf值）與顏色兩方面對藥物進(jìn)行定性，優(yōu)于HPLC和GC法（只能從色譜峰保留時間把握藥物的定性性質(zhì)），定量時僅用于有關(guān)物質(zhì)的限度檢測（半定量），結(jié)合不同原理的檢視技術(shù)，TLC法能見到分析的“全圖”（whole picture）,使各有關(guān)物質(zhì)斑點均可顯示，但變異比HPLC法大；HPLC和GC法的主要優(yōu)勢為定量，但如果運用得當(dāng)，尤其在含量測定或有關(guān)物質(zhì)項下已采用本法的情況下，利用對照品與供試品保留時間相同的特性作為鑒別依據(jù)，既不必專門實驗又增加了鑒別的專屬性，是非常可取的。由于分離分析的定量優(yōu)勢，HPLC或GC法成為新藥研發(fā)不可缺少的手段，尤其生物樣品中藥物的定量，HPLC或GC法為最常用的分析手段。
1、定性鑒別
色譜法對同系物或具有相同母核藥物（尤其制劑）的鑒別具有光譜法和化學(xué)法無可比擬的優(yōu)勢。但方法專屬性須經(jīng)充分驗證，確保結(jié)構(gòu)相近化合物或最難分離物質(zhì)對在擬定色譜條件下能良好分離。申報資料所用鑒別法的色譜條件多數(shù)與有關(guān)物質(zhì)、含量測定一致，實際上，在后兩者的方法學(xué)研究中，多以合成中間體、起始原料以及降解產(chǎn)物考察其專屬性，但在鑒別中，則以能夠與結(jié)構(gòu)相似的同類藥物良好分離為主要考慮，故在專屬性驗證中宜得到體現(xiàn)。
但在實際操作中有時遇到同一物質(zhì)在完全相同的色譜系統(tǒng)中保留時間不一致的情況，藥典中對保留時間（斑點位置）的一致性未予具體規(guī)定。對此，可采用如下措施：（1） 注意色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，流動相（展開劑）與固定相相匹配，在C18柱的反相色譜系統(tǒng)中，流動相有機溶劑比例不低于5％，避免C18鏈的隨機卷曲將造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定導(dǎo)致組份保留值波動的現(xiàn)象；TLC的色譜展開要適中，使主斑點的Rf值在0.2～0.7間。（2） 操作中另配制一供試品與對照品等量混合的溶液，進(jìn)樣（點樣）后出現(xiàn)單一色譜峰（斑點）作為鑒別依據(jù)，以彌補該法之不足。
2、有關(guān)物質(zhì)檢查
TLC法因設(shè)備和操作簡便、檢視（顯斑）方法多而較常用，但由于其變異性大，應(yīng)充分驗證系統(tǒng)的適用性，使各斑點Rf值在0.2－0.7之間，并應(yīng)分離清晰。新版歐洲藥典提出了斑點分離度計算公式：Rs=1.18α(RF2-RF1)/ωh1+ωh2(Rs:分離度，α：溶劑前沿，RF2、RF1：比移值，ωh1、ωh2：斑點寬)，可積累經(jīng)驗予以采納。雜質(zhì)檢測可用對照品比較法或自身對照法，前者用于已知雜質(zhì)控制并需雜質(zhì)對照品，也可兩種方法結(jié)合應(yīng)用，自身對照法應(yīng)注意雜質(zhì)斑點與主成分斑點色調(diào)應(yīng)一致，具有可比性，必要時可選用熒光薄層板，利用熒光熄滅法檢視，或兩種檢視方法結(jié)合應(yīng)用。結(jié)果的判斷，除控制雜質(zhì)的斑點數(shù)與限度外，也可采用兩種以上不同濃度的對照溶液分別比較。如某藥品，用自身稀釋成1.5%和0.5%兩種濃度的對照液，供試液如顯雜質(zhì)斑點，不得多于3個，允許1個超過0.5%，但不得過1.5%，其余雜質(zhì)斑點均不得過0.5%作限量要求。
在TLC法的方法學(xué)研究中，可配制多個展開劑系統(tǒng)及不同的吸附劑，進(jìn)行幾種組合的試驗，將主成分與已知的中間體、副產(chǎn)物、降解物或異構(gòu)體斑點的顏色及分離情況進(jìn)行對比，確定最佳色譜系統(tǒng)。同時要采用適宜的稀溶液驗證其靈敏度，確定合適的檢視方法，處理好靈敏度與雜質(zhì)限度的關(guān)系。并通過適當(dāng)改變展開劑比例及pH值，考察檢測方法的耐用性。由于影響TLC法重現(xiàn)性因素較多，如薄層板質(zhì)量、點樣技術(shù)、展開室溫濕度等都可能影響色譜分離度或靈敏度，需在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對分離度和靈敏度做出明確要求，如：實驗時，除供試液、對照液點樣外，主藥與另一結(jié)構(gòu)相近化合物（最難分離物質(zhì)對）混合溶液，以及另一低于標(biāo)準(zhǔn)限度的對照溶液同時點樣，要求混合溶液應(yīng)顯示分離良好的斑點，后者應(yīng)顯示清晰斑點，以確保檢測結(jié)果的可靠性。
根據(jù)藥物的理化性質(zhì)，HPLC法首選C18柱；流動相首選甲醇－水系統(tǒng)，必要時加入某種溶劑如乙腈或少量酸堿溶液、緩沖液等，以硅膠為載體的鍵合固定相填充劑適用pH2～8的流動相，pH大于8時，可使載體硅膠溶解，此時應(yīng)選用包覆聚合物填充劑、高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、非硅膠填充劑或有機－無機雜化填充劑等耐堿填充劑；pH小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落，此時應(yīng)選用有機－無機雜化填充劑、具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或而異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠等耐酸填充劑；如分離不好可選用其它類型柱和流動相，對某些品種需用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求時，可注明適用的牌號；檢測器首選UV檢測器，流動相合適時，蒸發(fā)光散射檢測器可能更好，可積極研究，成熟時予以采用。
采用的定量方法有：
（1）雜質(zhì)對照品法，即外標(biāo)法。僅限于對已知雜質(zhì)的控制，如采用該法，則應(yīng)注意對該對照品進(jìn)行定性研究，并制訂其質(zhì)量要求。
（2）加校正因子的主成分自身對照法，即以主成分作對照的內(nèi)標(biāo)法，校正因子可在檢測時測定，但需提供雜質(zhì)對照品，也可在建立方法時將測得的校正因子載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，供以后常規(guī)檢驗使用，無需長期提供雜質(zhì)對照品，但也僅適于已知雜質(zhì)的控制。
（3）不加校正因子的主成分自身對照法，實質(zhì)上也是以主成分作對照的內(nèi)標(biāo)法，但其前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子相同，適用于具有與主成分相同或類似發(fā)色團(tuán)的雜質(zhì)，因一般情況下，有關(guān)物質(zhì)與主成分具有相似的分子結(jié)構(gòu)，此法不致發(fā)生太大誤差。
（4）峰面積歸一法，簡便快捷，但因各雜質(zhì)響應(yīng)因子不一定相同、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍、儀器對微量雜質(zhì)和常量主成分的積分精度及準(zhǔn)確度不同等因素，可產(chǎn)生較大的誤差。
一般情況下，校正因子在0.9～1.1時可不予校正，即3法，校正因子在0.5～5.0以外時，應(yīng)改變檢測波長使在該范圍內(nèi)，如無法調(diào)節(jié)，應(yīng)采用（1）法；由于有關(guān)物質(zhì)中有已知的亦有未知的雜質(zhì)，故采用（1）＋（3）法或（2）＋（3）法比較理想，同時控制產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)；使用（3）法時，應(yīng)在考察已知有關(guān)物質(zhì)的校正因子（應(yīng)位于0.5～5.0以內(nèi)）或結(jié)合二極管陣列檢測結(jié)果（主成分與各有關(guān)物質(zhì)的UV吸收偏差應(yīng)不大）后采用，也可根據(jù)物料平衡原理（含量測定值與有關(guān)物質(zhì)值的和與供試品理論總量的偏差）驗證方法是否可行；一般不主張在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用（4）法，但在對映體雜質(zhì)的檢測中是一個簡捷的方法，也可用于穩(wěn)定性研究中對雜質(zhì)變化的監(jiān)測。
3、含量測定：色譜法按外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法以峰高或峰面積進(jìn)行定量。
內(nèi)標(biāo)法用于GC和HPLC減小測定誤差，曾經(jīng)起到很好的作用，特別是在GC中，進(jìn)樣量小，內(nèi)標(biāo)法能顯著提高定量精度，隨著現(xiàn)代分析儀器的發(fā)展，原手動進(jìn)樣已被定量環(huán)或自動化程度高的進(jìn)樣器所取代，內(nèi)標(biāo)法的應(yīng)用受到挑戰(zhàn)，尤其在HPLC中，由于進(jìn)樣量大，外標(biāo)法已具有很好的進(jìn)樣精度，加入內(nèi)標(biāo)，有時反而對分析不利，有研究者曾隨機選取藥典中八個內(nèi)標(biāo)法測定含量的藥品進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)法均不能提高分析精度，實際上，內(nèi)標(biāo)法使分析誤差與經(jīng)常校準(zhǔn)的外標(biāo)法相比增加了√2倍，說明測定兩個峰比測定一個峰引入的誤差要大。一般情況下，如下情況適合于使用內(nèi)標(biāo)法：復(fù)雜的樣品制備過程，如多次提?。坏蜐舛鹊臉悠罚`敏度是確定的），如藥代動力學(xué)的研究；在樣品分析中預(yù)計是很寬的濃度范圍，如藥代動力學(xué)研究。外標(biāo)法多用于原料驗收、成品質(zhì)控、穩(wěn)定性和TLC法，內(nèi)標(biāo)法多生物體液和GC法。需要注意的是，在外標(biāo)法中，保持供試品濃度與對照品濃度相近可以改善方法的準(zhǔn)確性。
峰高定量僅在峰高隨樣品量呈線性變化時使用，當(dāng)峰形不正或色譜柱超載時，峰高法會出現(xiàn)較大誤差，由于峰高測量受相鄰重疊峰的干擾較小，故比峰面積定量更為準(zhǔn)確，如BP中慶大霉素C組份檢測明確要求峰高定量。峰面積定量的好處是其精度受儀器參數(shù)變化的影響較小，對不是高斯分布的峰形也能較好定量，但其準(zhǔn)確度受相鄰峰重疊的影響。一般情況下，為得到較好的精確度，宜用峰面積定量；為最大限度地排除其它組份的干擾，則多用峰高定量。痕量分析中多用峰高法定量。
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